مقدمه
پروتئین مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول1 (PD-1)، یک گیرنده مهاری است که در طی فعال شدن توسط لنفوسیت‌های T بیان می‌شود. این پروتئین عملکرد سلول‌های T را در طول پاسخ‌های مختلف فیزیولوژیکی مانند عفونت حاد و مزمن، سرطان و خودایمنی، در هموستاز ایمنی تنظیم می‌کند [1, 2]. PD-1 یک گلیکوپروتئین سطحی منومر است و توسط ژن PDCD1 که شامل 5 اگزون است، کدگذاری می‌شود. این پروتئین دارای موتیف‌های مهاری مبتنی بر گیرنده ایمنی تیروزین و یک موتیف سوئیچ گیرنده ایمنی تیروزین می‌باشد [3 ,4]. PD-1 ‌به‌طور القایی بر روی لنفوسیت‌های T با مارکر سطحی CD4 و CD8، سلول‌های کشنده طبیعی (NK)، سلول‌های B، ماکروفاژها و برخی زیر مجموعه‌های سلول‌های دندریتیک (DC) بیان می‌شود. برخی از سیتوکین‌ها مانند اینترلوکین-2 ، اینترلوکین-7 و اینترفرون‌ها می‌توانند بیان PD-1 را در سلول‌های T القا کنند [5]. PD-1 دارای دو لیگاند طبیعی به نام PD-L1 و PD-L2 است که در انتقال سیگنال PD-1/PD-L1,2 نقش دارند. PD-1 عمدتاً بر روی سلول‌های T فعال‌شده بیان می‌شود، درحالی‌که لیگاند اصلی آن، PD-L1، بر سطح سلول‌های مختلف (مانند سلول‌های T و B، سلول‌های کشنده طبیعی، سلول‌های ارائه‌کننده آنتی ژن، سلول‌های اپیتلیال و سلول‌های آندوتلیال عروقی) بیان می‌شود [6]. 
 یکی از نقاط بازرسی ایمنی که بسیاری از تومورها برای فرار از سیستم ایمنی استفاده می‌کنند، محور پروتئین‌های PD-1 و لیگاند آن است. در سلول‌های سرطانی ژن PD-L1 دچار افزایش بیش از حد بیان ژن می‌شود و تعداد پروتئین‌های PD-L1 در سطح آن‌ها افزایش می‌یابد. در سرطان، سیستم PD-1/PD-L1 از تکثیر لنفوسیت‌های T، آزادسازی سیتوکین‌ها و سمیت سلولی جلوگیری می‌کند [7, 8, 9] که منجر به آپوپتوز سلول‌های T اختصاصی تومور می‌شود و درنتیجه به سلول‌های سرطانی فرصتی برای جلوگیری از پاسخ ایمنی و رشد و گسترش می‌دهد [10]. ایمونوتراپی سرطان اخیراً با هدف طراحی درمان‌های مؤثر برای بهبود ویژگی و قدرت سیستم ایمنی در برابر سرطان توسعه یافته است [11]. جیمز پی آلیسون و تاسوکو هونجو جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی 2018 را برای کشف یک درمان سرطان با سرکوب تعدیل ایمنی منفی دریافت کردند. تحقیقات آن‌ها بر روی نقاط بازرسی ایمنی برنامه‌ریزی‌شده مثل PD-1 و پروتئین 4 سیتوتوکسیک مرتبط با لنفوسیت (CTLA-4)، نشان داد که این پروتئین‌ها دارای نقش بازدارنده در عملکرد ایمنی هستند و پیشنهاد می‌کنند این نقاط بازرسی ایمنی را می‌توان مهار کرد تا دوباره سلول‌های T فعال شوند تا بتوانند سلول‌های سرطانی را به‌طور مؤثری از بین ببرند [12]. این مطلب در تحقیقات بی‌شمار بعدی به اثبات رسید. در حال حاضر به‌عنوان یک نظریه اثبات‌شده می‌باشد که با مهار عملکرد این پروتئین‌های مهاری می‌توان به اهداف درمانی در بهبود سرطان دست یافت. 
شواهد زیادی نشان می‌دهد مهار PD-1 یک پاسخ ایمنی مؤثر در برابر سلول‌های سرطانی را نشان می‌دهد [13]. سرکوب مسیر سیگنالینگ PD-1 نشان داده است پاسخ بالینی بیماران مبتلا به تومورهای جامد مختلف و بدخیمی‌های خونی، عمدتاً به سلول‌های T برای نفوذ به تومور متکی است [14]. علاوه‌براین، هدف قرار دادن PD-L1 با پاسخ بالینی قابل توجهی در طیف وسیعی از بیماران سرطانی همراه بوده است. درواقع، PD-1 یک نشانگر ایمونولوژیک قابل توجه است که نقش منفی در پیش‌آگهی سرطان‌های مختلف دارد. بنابراین، تشخیص مولکولی پروتئین PD-1 یک هدف مهم در بسیاری از تحقیقات می‌باشد [15]. 
آنتی‌بادی‌ها در آزمایش‌های متعدد ایمونوتراپی و ایمونواسی به‌عنوان واکنشگرهای ضروری روزمره می‌باشند. برای تولید آنتی بادی‌ها از حیوانات مختلفی مانند موش، بز، گوسفند، اسب، خرگوش و شتر استفاده می‌شود. آنتی‌بادی‌های پلی کلونال چندین شاخص آنتی ژنی را می‌توانند شناسایی کنند، درحالی‌که آنتی‌بادی‌های منوکلونال تنها یک اپی توپ را شناسایی کردند و اختصاصی هستند. آنتی‌بادی‌های مورد استفاده در تست‌های تشخیصی را می‌توان از منابع حیوانی مختلف به دست آورد، اما آنتی‌بادی‌های درمانی بایستی از منابع انسانی حاصل شوند، زیرا سبب ایجاد واکنش‌های ایمنولوژیک در بدن خواهند شد. در صورتی که آنتی‌بادی‌های درمانی از حیوانات مثل موش به دست آیند، بایستی بخش‌های ثابت آن با بخش ثابت آنتی‌‌بادی‌های انسانی جایگزین شوند تا آنتی‌بادی‌های کایمریک یا انسانی‌شده حاصل شود. 
سرم شترسانان حاوی دو نوع آنتی‌بادی یعنی آنتی بادی‌های معمول و آنتی بادی‌های زنجیره سنگین یا HcAbs می‌باشد. آنتی بادی‌های زنجیره سنگین نوعی از ایمونوگلوبولین‌های G یا IgG می‌باشند که ساختار آن‌ها تنها از دو زنجیره سنگین تشکیل شده است و زنجیره سبک ندارند. علاوه‌براین، آن‌ها دارای دو دومین ثابت CH2 و CH3 هستند که با دامنه‌های Fc آنتی‌بادی‌های معمولی مشابه هستند، اما فاقد دومین CH1 هستند. محل اتصال آنتی ژن در HcAbs‌ها بسیار منحصر به فرد بوده و تنها دارای یک دومین متغیر به نام VHH، نانو آنتی‌بادی یا نانوبادی است. دومین VHH بسیار کوچک (15-17 کیلو دالتون) بوده که با حلالیت بالا و مقاومت در برابر درجه حرارت، فشار بالا و pH پایین شناخته می‌شود [16-18]. 
باتوجه‌به مزایای آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین شتری و نیاز به تولید آنتی‌بادی علیه hPD-1 در این پژوهش، ژن بخش خارج سلولی پروتئین hPD-1 در وکتور باکتریایی کلون شد و پروتئین نوترکیب بیان و خالص‌سازی شد. سپس یک شتر، با پروتئین نوترکیب PD-1 ایمن‌سازی شد. کارآیی آنتی‌بادی پلی کلونال به‌دست‌آمده در روش‌های آزمایشگاهی الایزا و وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت. 

مواد و روش‌ها
کلونینگ، بیان و تخلیص پروتئین انسانی PD-1
توالی قسمت خارج سلولی PD-1 انسانی (UniprotKB Q15116) حاوی His-tag، سنتز شد و در پلاسمید pGH کلون و به نام PD1-pGH نام‌گذاری شد. سپس ژن PD1 انسانی در وکتور pET-26b بین جایگاه‌های NdeI وXhoI  ساب کلون شد. برای تأیید فرایند کلونینگ از روش‌های colony-PCR و هضم آنزیمی تأییدی استفاده شد. پلاسمید نهایی(PD1-pET26b) به باکتری E.coli BL21-DE3 ترانسفورم شد و القا بیان پروتئین PD-1، با غلظت نهایی 0/5 میلی‌مولار ایزوپروپیل-بتا-دی-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) به‌مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور انجام شد. خالص‌سازی پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA انجام شد. به‌طور خلاصه، رسوب باکتری‌ها با بافر لیز‌کننده حل و سونیکه شد. مایع رویی سلول به‌وسیله فیلتر سرنگی 0/45 میکرومتر فیلتر شد و با رزین Ni-NTA، به‌مدت 1 ساعت روی یخ انکوبه شد. سپس رزین بر روی ستون ریخته شد و توسط بافر شست‌وشو، شست‌وشو داده شد و پروتئینPD-1 با بافر الوشن از ستون خارج شد. خلوص پروتئین با ژل الکتروفورز عمودی (SDS-PAGE) مورد ارزیابی قرار گرفت. درنهایت نمونه‌های پروتئینی در برابر محلول بافر فسفاته (PBS) دیالیز شدند و سپس نمونه‌ها لیوفیلیزه شدند. 

وسترن بلاتینگ
برای تأیید هویت پروتئین PD-1 وسـترن بلاتینگ انجام شد. پروتئین تخلیص شده پس از الکتروفـورز روی ژل SDS-PAGE به غشاء نیتروسلولز منتقـل شـد. سپس غشاء بـه‌ترتیـب بـا آنتـی‌بـادی خرگوشی علیه His-tag با رقت 1/2000 به‌مدت 16 ساعت و آنتـی‌بـادی ثانویه (آنتی‌بادی ضدخرگوشی کونژوگه ) به‌مدت 5 ساعت در دمای 25 درجه انکوبه شد. بعد از انکوبـه کـردن غشـا بـا آنتـی‌بـادی ثانویـه، جهـت مشاهده باند پروتئین از سوبسترای 4-کلرونفتل و هیدروژن پراکسید (H2O2) استفاده شد. در هر مرحله غشاء نیتروسلولز 3 بار با بافر PBS شست‌وشو داده شد. 

ایمنی‌سازی شتر 
برای ایمن‌سازی از یک شتر Camelus dromedaries ماده 9 ماهه استفاده شد. برای اولین تزریق، 100 میکروگرم از پروتئین نوترکیب PD-1با حجم مساوی از ادجوانت کامل فروند (Sigma، USA) مخلوط شد. سپس در 6 تزریق بعدی پروتئین با ادجوانت ناقص فروند به‌صورت زیر جلدی، با فواصل هفتگی، برای افزایش پاسخ ایمنی استفاده شد. نمونه‌های خون محیطی قبل از هر تزریق جمع‌آوری و سرم‌ها از خون تام جدا شدند. برای بررسی روند ایمن‌سازی شتر از روش الایزا استفاده شد. 

تست الایزا
در تست الایزا، 100 میکرولیتر از غلظت 1 میکروگرم در چاهک از پروتئین نوترکیب PD-1 بر روی میکروپلیت صاف 96 خانه با بافر سدیم بی‌کربنات (pH 9. 1) به‌مدت 1 ساعت در دمای 25 درجه کووت شد. به دنبال آن پلیت با بافر شست‌وشو (PBS) 3 بار شست‌وشو داده شد و با شیر خشک بدون چربی 4 درصد بلاکینگ انجام شد. رقت‌های سرم از 1/200 تا 1/14000 به چاهک‌های میکروپلیت اضافه شد و سپس میکروپلیت به‌مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. بعد از شست‌وشو به‌ترتیب آنتی‌بادی خرگوشی ضدشتری و آنتی‌بادی ضدخرگوشی کانژوگه با HRP در رقت 1/2000 به چاهک‌ها اضافه شد و هرکدام به‌مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. بعد از شست‌وشوی نهایی 100 میکرولیتر از محلول TMB به چاهک‌ها اضافه و بعد از مدت 5 دقیقه با محلول اسید سولفوریک 2 نرمال واکنش متوقف شد. سپس OD چاهک‌ها در طول موج 450 نانومتر قرائت شد. 

تأیید بیان ژن با الکتروفورز پروتئین
پروتئین نوترکیب PD-1 تخلیص شده و کیفیت تخلیص با روش SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور ژل آکریلامید 15 درصد آماده شد و نمونه‌های پروتئین با بافر لودینگ حاوی 2ME به‌مدت 10 دقیقه جوشانده شد. سپس در کنار مارکر بر روی ژل قرار داده شد و فرآیند الکتروفورز با ولتاژ 80 ولت انجام شد. سپس ژل با رنگ کوماسی بلو R250 رنگ‌آمیزی شد. 

وسترن بلات با آنتی‌بادی شتری
الکتروفورز پروتئین نوترکیب PD-1 تخلیص‌شده انجام شد. سپس به‌روش نیمه‌خشک (45 دقیقه، 15 ولت) به غشا نیتروسلولز منتقل شد. همه مراحل شست‌وشو با بافر PBS 3 بار در هر مرحله انجام شد. سرم شتری که دارای آنتی‌بادی پلی کلونال شتری بر علیه پروتئین نوترکیب PD-1 با رقت 1/200 بر روی غشاء نیترو سلولز به‌مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. بعد از شست‌وشو، آنتی‌بادی خرگوشی ضدشتری و آنتی‌بادی ضدخرگوشی کانژوگه با HRP با رقت 1/2000 به‌ترتیب هرکدام به‌مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه و جهـت مشاهده پروتئین از سوبسترای 4- کلرونفتل و هیدروژن پراکسیداز (H2O2) استفاده شد. 

یافته ها
کلونینگ پروتئین PD-1 انسانی 
برای بیان و تخلیص پروتئین PD-1، توالی کد‌کننده پروتئین PD-1 انسانی در داخل پلاسمید بیانی pET-26 با استفاده از جایگاه‌های آنزیمی کلونینگNdeI و XhoI کلون شد و به باکتری E.coli Top10F’ ترانسفرم شد. تأیید کلونینگ و ترانسفورماسیون پلاسمید، با کلونی PCR (تصویر شماره 1 الف) و هضم آنزیمی پلاسمید (تصویر شماره 1 ب) انجام شد. 

بیان و تخلیص پروتئین انسانی PD-1
پلاسمید نوترکیب نهایی pET26b-PD1 به میزبان بیانی E.coli BL21-DE3 ترانسفورم شد. بیان ژن با 0/5 میلی‌مولار IPTG در دمای 37 درجه به‌مدت 3 ساعت القا شد (حجم 100میلی‌لیتر). بیان پروتئینPD-1 با 15% SDS-PAGE تأیید شد (تصویر شماره 2 الف).

تخلیص پروتئین در حالت دناتوره انجام شد. پروتئین تخلیص‌شده توسط SDS-PAGE و وسترن بلات (تصویر شماره 2 ب و ج) با آنتی‌بادی anti-His HRP تأیید شد. بازده بیان پروتئین 3/6 میلی‌گرم در لیتر محیط کشت محاسبه شد. 

بررسی ایمن‌سازی شتر
برای ایمن‌سازی شتر از پروتئین نوترکیب PD-1 استفاده شد. براساس پروتکل استاندارد تزریق‌ها با فاصله هفته‌ای 1 بار و 6 بار انجام شد. برای بررسی پاسخ ایمنی هومورال در شتر از روش الایزا استفاده شد. برای این منظور پیش‌از هر بار تزریق از شتر خون‌گیری شد. همان‌طور که در تصویر شماره 3 نشان داده شده است، پس از تزریق سوم میزان آنتی‌بادی اختصاصی علیه آنتی ژن بالا رفته است.

در تزریق سوم، رقت 1/16000 از سرم در تست الیزا OD معادل 1 داشت که نشان‌دهنده غلظت بالای آنتی‌بادی می‌باشد. 

وسترن بلات
برای تأیید قدرت اتصال سرم شتر حاوی آنتی‌بادی‌های پلی کلونال ضد PD-1 به پروتئین از روش وسترن بلات استفاده شد. اتصال آنتی‌بادی پلی کلونال به hPD-1 و با روش وسترن بلاتینگ اثبات شد (تصویر شماره 4).

این موضوع نشان داد آنتی‌بادی پلی کلونال تهیه‌شده قادر به شناسایی آنتی ژن در وسترن بلات می‌باشد و می‌تواند برای این تست مورد استفاده قرار گیرد. 
بحث
پروتئین مرگ برنامه‌ریزی شده-1 یک گیرنده مهاری است که بر روی سلول‌های ایمنی ذاتی و اکتسابی سازگار بیان می‌شود که برای تنظیم التهاب و خود واکنشی حیاتی است. در حال حاضر مشخص شده است که در سرطان‌ها، از طریق بیان لیگاند مرگ برنامه‌ریزی شده-1، فعال‌سازی PD-1 بر روی سلول‌های ایمنی متوقف شده است و به این واسطه سلول‌های سرطانی از سلول‌های سیستم ایمنی فرار می‌کنند [19]. درنتیجه، مهارکننده‌های این پروتئین‌ها مانند آنتی‌بادی‌هایی که علیه PD-1 و لیگاند آن توسعه یافته‌اند، می‌توانند برای تقویت مجدد ایمنی ضد توموری و بهبود بیماری، مورد استفاده قرار گیرند [20]. یکی از اقدامات لازم در درمان با استفاده از آنتی بادی‌های منوکلونال سنجش میزان مولکول هدف در بیمار تحت درمان می‌باشد. در این زمینه می‌توان به 3 کیت تشخیصی مورد تأیید FDA که برای طبقه‌بندی بیماران و استفاده ایمن و مؤثر از داروهای مربوطه ضروری است، اشاره کرد [21]. 
کیت Ventana SP142 برای بررسی کارآیی داروی آتزولیزوماب که یک آنتی‌بادی منوکلونال علیه PD-L1 و بر پایه ایمنوهیستوشیمی است، برای تشخیص در بیماران مبتلا به کارسینوم مثانه، سرطان سینه 3 گانه منفی و سرطان ریه سلول غیرکوچک (NSCLC) استفاده می‌شود. همچنین دو کیت Dako 28-8 و Dako Omnis برای بررسی میزان PD-L1 در برخی از بیماران سرطانی که دریافت‌کننده آنتی‌بادی‌های درمانی هستند، استفاده می‌شود. این موضوع نشان از اهمیت بررسی میزان بیان این پروتئین‌ها در بیماران دریافت‌کننده داروها می‌باشد، بنابراین بررسی PD-1 در تکنیک‌های آزمایشگاهی بسیار مهم است. 
با وجود مزایای تشخیصی و درمانی آنتی‌بادی‌های منوکلونال، هنوز هم از آنتی‌بادی‌های پلی کلونال در کارهای تشخیصی و درمانی استفاده می‌شود. کاهش زمان و هزینه تولید، داشتن ساختار متعادل، تحمل تنش‌های محیطی و توانایی اتصال به چند اپی توپ از مزایایی است که تولید، ذخیره‌سازی و کاربرد پلی کلونال آنتی‌بادی‌ها را تسهیل می‌کند. از زمان کشف آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین در سرم شترسانان این نوع از آنتی بادی‌ها نیز به‌طور گسترده در تشخیص و درمان استفاده شده است [22]. 
در این مطالعه قسمت خارج سلولی پروتئین انسانی hPD-1 در میزبان پروکاریوتی بیان شد. سپس پروتئین hPD-1 با کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA در شرایط دناتوره‌کننده با اوره خالص شد. در مطالعه مشابهی که توسط ژانساوا و همکاران در سال 2020 انجام شد، بخش خارج سلولی hPD-1 در وکتور pET28 کلون شد. در این مطالعه تلاش شد تا پروتئین به‌صورت محلول به دست آید، بنابراین مقادیر مختلف IPTG و شرایط دمایی مورد ارزیابی قرار گرفت. درنهایت میزان mM 0/2 از IPTG و دمای 25 درجه به‌عنوان شرایط کشت بهینه عنوان شد. اندازه پروتئین در آن پژوهش KDa 21 به دست آمد، درحالی‌که در مطالعه حاضر حدود KDa 17/5 بود، علت این تفاوت می‌تواند مربوط به محل استخراج پروتئین (داخل یا خارج سلول) و داشتن یا نداشتن ساختارهای ثانویه در پروتئین باشد [23]. 
پروتئین تخلیص‌شده به یک شتر 9 ماهه با 6 بار تکرار و به‌صورت 2 هفته 1 بار به‌صورت زیر جلدی تزریق شد. با روش الایزا روند ایمن‌سازی شتر مورد بررسی قرار گرفت. داده‌ها نشان داد شتر در برابر قسمت خارج سلولی پروتئین PD-1 با تیتر بالایی از آنتی‌بادی پلی کلونال شتر علیه PD-1 ایمن شده بود. در مطالعات مشابهی که توسط تیم ما در خصوص آنتی‌بادی‌های پلی کلونال شتری علیه پروتئین‌هایLIV-1 [24]، CTLA-4 [25]، PlGF [26] صورت گرفت نیز نشان داده شد که پروتئین‌های نوترکیب می‌توانند به‌عنوان یک منبع آنتی ژنی مناسب برای تحریک سیستم ایمنی شتر باشند. همچنین در مطالعه بهدانی و همکاران در سال 2012 از سلول بیان‌کننده آنتی ژن VEGFR2 به‌عنوان منبع آنتی ژن برای ایمن‌سازی شتر استفاده کردند و کارآیی سلول را به‌عنوان آنتی ژن نشان دادند [27].
 درمجموع می‌توان نتیجه گرفت که برای ایمن‌سازی شتر همانند سایر پستانداران می‌توان از منابع مختلف آنتی ژن استفاده کرد. اتصال آنتی‌بادی پلی کلونال شتری به پروتئین PD-1 در روش‌های الایزا و وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت و نتایج نشان داد این آنتی‌بادی قادر به اتصال و شناسایی پروتئین hPD-1 را در تست‌های آزمایشگاهی یادشده دارا می‌باشد. این قابلیت در سایر مطالعات نیز نشان داده شده است [24، 26]. یکی از کاربردهایی که برای آنتی‌بادی‌های پلی کلونال شتری، به‌علت توانایی مقاومت آن‌ها در شرایط سخت می‌توان متصور بود، استفاده به‌عنوان آنتی سرم‌های درمانی برای درمان بیماران گزش‌یافته توسط جانداران سمی می‌باشد. 
در مطالعه مدب-مولهی و همکاران در سال 2003 از آنتی سرم شتری ضد عقرب Androctonus australis hector استفاده شد و نشان دادند این آنتی سرم توانایی خنثی‌سازی سم را دارا می‌باشد [28]. همچنین در مطالعه بهدانی و همکاران قابلیت خنثی‌سازی آنتی سرم شتری در خنثی‌سازی عقرب Hemiscorpius lepturus نشان داده شد [29]. می‌توان آنتی‌بادی پلی کلونال علیه PD-1 را به‌عنوان یک آنتی سرم درمانی پلی کلونال جهت جلوگیری از رشد سلول‌های سرطانی در شرایط برون‌تنی و درون‌تنی مورد ارزیابی قرار داد. 

نتیجه‌گیری
درنهایت می‌توان آنتی‌بادی پلی کلونال حاصله را به‌عنوان یک آنتی‌بادی مناسب برای تست‌های تشخیصی مثل الایزا وسترن بلات ونیز فلوسیتومتری و ایمنوهیستوشیمی  مورد استفاده قرار داد. 

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کد اخلاق این طرح به شماره IR. PII. REC. 1400. 041مصوب کمیته اخلاق انستیتو پاستور ایران می‌باشد. 

حامی مالی
این مقاله با حمایت مالی انستیتو پاستور ایران از طریق طرح شماره 1805 انجام شد. 

مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشتند. 

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.

تشکر و قدردانی
از همکاری دکتر دلاور شهباززاده برای تلاش‌های مؤثرشان در به نتیجه رسیدن این پروژه تقدیر و تشکر می‌شود. 

References
1.Bardhan K, Anagnostou T, Boussiotis VA. The PD1: PD-L1/2 pathway from discovery to clinical implementation. Frontiers in Immunology. 2016; 7: 550. [DOI: 10. 3389/fimmu. 2016. 00550] [PMID] [PMCID]
2.Shrimali RK, Janik JE, Abu-Eid R, Mkrtichyan M, Khleif SN. Programmed death-1 & its ligands: Promising targets for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 2015; 7(7): 777-92. [DOI: 10. 2217/imt. 15. 49] [PMID]
3.Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. The EMBO Journal. 1992; 11(11): 3887-95. [DOI: 10. 1002/j. 1460-2075. 1992. tb05481. x] [PMID] [PMCID]
4.Shinohara T, Taniwaki M, Ishida Y, Kawaichi M, Honjo T. Structure and chromosomal localization of the human PD-1 gene (PDCD1). Genomics. 1994; 23(3): 704-6. [DOI: 10. 1006/geno. 1994. 1562] [PMID]
5.Terawaki S, Chikuma S, Shibayama S, Hayashi T, Yoshida T, Okazaki T, et al. IFN-alpha directly promotes programmed cell death-1 transcription and limits the duration of T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 2011; 186(5): 2772-9. [DOI: 10. 4049/jimmunol. 1003208] [PMID]
6.Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: From discovery to clinical application. International Immunology. 2007; 19(7): 813-24. [DOI: 10. 1093/intimm/dxm057] [PMID]
7.Muenst S, Soysal SD, Gao F, Obermann EC, Oertli D, Gillanders WE. The presence of programmed death 1 (PD-1)-positive tumor-infiltrating lymphocytes is associated with poor prognosis in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 2013; 139(3): 667-76. [DOI: 10. 1007/s10549-013-2581-3] [PMID] [PMCID]
8.Dong Y, Wong JSL, Sugimura R, Lam KO, Li B, Kwok GGW, et al. Recent advances and future prospects in Immune Checkpoint (ICI)-based combination therapy for advanced HCC. Cancers (Basel). 2021; 13(8): 1949. [DOI: 10. 3390/cancers13081949] [PMID] [PMCID]
9.Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science. 2015; 348(6230): 56-61. [DOI: 10. 1126/science. aaa8172] [PMID]
10.Sun S, Fei X, Mao Y, Wang X, Garfield DH, Huang O, et al. PD-1(+) immune cell infiltration inversely correlates with survival of operable breast cancer patients. Cancer Immunology, Immunotherapy: CII. 2014; 63(4): 395-406. [DOI: 10. 1007/s00262-014-1519-x] [PMID]
11.Salmaninejad A, Valilou SF, Shabgah AG, Aslani S, Alimardani M, Pasdar A, et al. PD-1/PD-L1 pathway: Basic biology and role in cancer immunotherapy. Journal of Cellular Physiology. 2019; 234(10): 16824-37. [DOI: 10. 1002/jcp. 28358] [PMID]
12.Ljunggren HG, Jonsson R, Hoglund P. Seminal immunologic discoveries with direct clinical implications: The 2018 Nobel Prize in Physiology or Medicine honours discoveries in cancer immunotherapy. Scandinavian Journal of Immunology. 2018; 88(6): e12731. [DOI: 10. 1111/sji. 12731] [PMID]
13.Messenheimer DJ, Jensen SM, Afentoulis ME, Wegmann KW, Feng Z, Friedman DJ, et al. Timing of PD-1 blockade is critical to effective combination immunotherapy with Anti-OX40. Clinical Cancer Research. 2017; 23(20): 6165-77. [DOI: 10. 1158/1078-0432. CCR-16-2677] [PMID] [PMCID]
14.Iwai Y, Hamanishi J, Chamoto K, Honjo T. Cancer immunotherapies targeting the PD-1 signaling pathway. Journal of Biomedical Science. 2017; 24(1): 26. [DOI: 10. 1186/s12929-017-0329-9] [PMID] [PMCID]
15.Sacher AG, Gandhi L. Biomarkers for the clinical use of PD-1/PD-L1 inhibitors in non-small-cell lung cancer: A review. JAMA Oncology. 2016; 2(9): 1217-22. [DOI: 10. 1001/jamaoncol. 2016. 0639] [PMID]
16.Muyldermans S. Applications of nanobodies. Annual Review of Animal Biosciences. 2021; 9: 401-21. [DOI: 10. 1146/annurev-animal-021419-083831] [PMID]
17.Muyldermans S. A guide to: Generation and design of nanobodies. The FEBS Journal. 2021; 288(7): 2084-102. [DOI: 10. 1111/febs. 15515] [PMID] [PMCID]
18.Rahbarizadeh F, Ahmadvand D, Sharifzadeh Z. Nanobody; an old concept and new vehicle for immunotargeting. Immunological Investigations. 2011; 40(3): 299-338. [DOI: 10. 3109/08820139. 2010. 542228] [PMID]
19.Dong H, Strome SE, Salomao DR, Tamura H, Hirano F, Flies DB, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: A potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 2002; 8(8): 793-800. [DOI: 10. 1038/nm730] [PMID]
20.Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, Gettinger SN, Smith DC, McDermott DF, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. The New England Journal of Medicine. 2012; 366(26): 2443-54. [DOI: 10. 1056/NEJMoa1200690] [PMID] [PMCID]
21.Food and Drug Administration. List of cleared or approved companion diagnostic devices (in vitro and imaging tools). Maryland: Food and Drug Administration; 2022. [Link]
22.Pillay TS, Muyldermans S. Application of single-domain antibodies (“Nanobodies”) to laboratory diagnosis. Annals of Laboratory Medicine. 2021; 41(6): 549-58. [DOI: 10. 3343/alm. 2021. 41. 6. 549] [PMID] [PMCID]
23.Zhansaya A, Kanatbek M, Kanat T, Bakhytkali I, Darkhan K, Arman K, et al. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor. Reports of Biochemistry & Molecular Biology. 2020; 8(4): 347-57. [PMID]
24.Ghaderi H, Noormohammadi Z, Habibi-Anbouhi M, Kazemi-Lomedasht F, Behdani M. [Preparation of heavy chain polyclonal antibody against zinc transporter SLC39A6 and its diagnostic application (Persian)]. Tehran University Medical Journal. 2021; 79(4): 274-80. [Link]
25.Sotoudeh N, Noormohammadi Z, Habibi-Anbouhi M, Kazemi-Lomedasht F, Behdani M. Evaluation of laboratory application of camelid sera containing heavy-chain polyclonal antibody against recombinant cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4. Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy. 2019; 38(6): 235-41. [DOI: 10. 1089/mab. 2019. 0031] [PMID]
26.Arezumand R, Mahdian R, Behdani M, Khanahmad H, Langari J, Namvarasl N, et al. Recombinant expression and purification of human placental growth factor 1 and specific camel heavy chain polyclonal antibody preparation. Saudi Journal of Biological Sciences. 2014; 21(1): 35-9. [DOI: 10. 1016/j. sjbs. 2013. 04. 008] [PMID] [PMCID]
27.Behdani M, Zeinali S, Khanahmad H, Karimipour M, Asadzadeh N, Azadmanesh K, et al. Generation and characterization of a functional Nanobody against the vascular endothelial growth factor receptor-2; angiogenesis cell receptor. Molecular Immunology. 2012; 50(1-2): 35-41. [DOI: 10. 1016/j. molimm. 2011. 11. 013] [PMID]
28.Meddeb-Mouelhi F, Bouhaouala-Zahar B, Benlasfar Z, Hammadi M, Mejri T, Moslah M, et al. Immunized camel sera and derived immunoglobulin subclasses neutralizing Androctonus australis hector scorpion toxins. Toxicon. 2003; 42(7):785-91. [DOI: 10. 1016/j. toxicon. 2003. 10. 021] [PMID]
29.Behdani M, Hosseini Nejad Chafi M, Zeinali S, Karimipour M, Khanahmad-Shahreza H, Ghasemi P, et al. [Antiserum production in immunized camel by the venom of Hemiscorpius lepturus scorpion: Evaluation of neutralizing test in vivo (Persian)]. Tehran University Medical Journal. 2010; 68(5):268-73. [Link]